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心肌细胞（Cardiomyocytes，CMs）的丢失及瘢痕形成是导致心肌梗死、心力衰竭主要原因。哺乳动物在出生后心肌细胞的数目便不再增加，终末分化的成体CMs也没有再生能力。之前的研究表明，心源性转录因子Gata4、Hand2、Mef2c、Tbx5以及Akt1（AGHMT）是心肌细胞重编程过程中的关键转录因子，它们不仅可以结合在各自的超级增强子区域，同时也可以互相结合，形成一个关键的转录调控循环[1,2]。AMGHT等可以直接将成纤维细胞（fibroblast）重编程为诱导的心肌细胞（inducedcardiac-likemyocytes，iCLMs）[3]，从而为心脏损伤后修复提供潜在的细胞来源，这也是一种非常有潜力的心脏再生的治疗方法[4,5]。但是目前心肌细胞重编程的效率较低，分子机制不甚清晰，极大限制了该技术的转化研究。
在这个过程中，表观遗传很明显地影响着成体纤维细胞重编程的发生[6,7]。年5月份，来自美国德克萨斯大学西南医学中心的EricN.Olson课题组，联手RhondaBasselDuby课题组，共同发现了一个在成体纤维组织进行心肌细胞重编程的调控因子PHF7。PH7之前报道是组蛋白阅读器，识别H3K27me2以及H3K27me3修饰，并且在细胞命运决定过程中发挥重要作用[8]。研究工作者在上千的哺乳动物调控因子中筛选到PHF7基因，发现它可以很好地激活这个过程，为心脏创伤后修复提供了很好的科研基础。
图1：PHF7促进心脏重编程过程
他们通过α-myosin重链启动子区融合GFP（α-MHC–GFP）标记的小鼠的荧光强度以及心肌肌钙蛋白(cTnT:TcardiactroponinT)的表达来进行检测。他们利用带有α-MHC–GFP标记的三种不同来源的纤维细胞进行诱导，TTF（adulttail-tipfibroblasts），MEFs（mouseembryonicfibroblast）以及CFs（cardiacfibro-blasts）。通过AGHMT（5个关键的心源性转录因子）以及AGHMT+PHF7的诱导，检测最终形成心肌细胞的效率（图1a）。结果显示，PHF7的加入，可以很大程度上提高三种来源纤维细胞的重编程效率（图1b）。其中尾尖来源的TTF的效率提高最明显，加入PHF7的实验组，诱导效率从2%提高到20%（图1c）。同时，他们发现，在MEF诱导的重编程过程中，诱导第一天，就产生了绿色标记的MHC阳性细胞，说明加入PHF7可以有效地促进了诱导过程的发生。
同时他们也检测了目前诱导难度最大的纤维细胞（人类成体的心脏纤维细胞），发现加入PHF7之后，cTnT以及MHC阳性的细胞比例提高了大约2倍，说明PHF7也可以很好地促进人类成体心脏纤维细胞的重编程过程（图2d,e）。
图2：PHF7促进人类成体心脏纤维细胞的重编程过程
为了进一步确定PHF7对于重编程的作用，他们将小鼠成体TTFs进行7天的诱导，对其进行RNA测序分析。发现相对于只加入AGHMT五因子，同时加入PHF7之后，转录组发生了明显的改变，大约个基因上调，以及个基因下调（图3b）。这些上调的基因包括成熟的心肌结构蛋白Ttn、Actc1、Actn2、Tcap、Tnni31、Tnni1，以及心脏发育相关的Tbx20，Smyd1以及Myocd等（图3c）。功能分析发现，PHF7主要是上调与心肌发育以及收缩相关的基因（图3d）。而下调的基因，主要是与炎症性、趋化性、ERKmotactic、ERK以及肿瘤坏死因子信号通路相关（图3e），这些下调基因多数也是与增殖以及抑制重编程过程相关的基因。
图3：PHF7促进心脏相关转录组的表达
因为PHF7可以很有效地促进心肌细胞重编程的发生，所以研究人员推测，PHF7促进重编程过程是否与AGHMT五因子的中的某几个就可以实现，所以他们尝试了很多种的组合。结果显示在没有Gata4的情况下，PHF7与Mef2c以及Tbx5(MT)也可以达到类似的重编程效果，简称PMT（图4a）。免疫组化以及流式分析也得到了类似的结论。同时PMT与AGHMT五因子诱导的Gata4的表达水平类似，PMT进行的重编程过程形成的心肌细胞，有检测到自发的钙火花，说明这是有功能的心肌细胞。
图4：无外源Gata4的情况下，PHF7可以实现心肌细胞命运的重编程
为了进一步明确PHF7促进重编程的机制，他们以未加入AGHMT五因子的MEFs为对照，通过ChIP实验，鉴定到在加入PHF7以及AGHMT五因子的条件下，PHF7在基因组上结合发生了明显变化，有12,个区域的结合增强，22,个区域的结合减弱（图5b）。PHF7在基因组上的结合motif主要是Gata4、AP-1、TEAD以及Mef2（图5c）。而PHF7结合的基因组区域，同时也有明显的GHMT转录因子结合，以及H3K27ac明显富集，说明这些基因位置活跃，并且这些转录因子与PHF7很可能共同结合在这些区域发挥作用，共同促进重编程过程的发生（图5d）。
图5：PHF7结合在心肌增强子区域
他们对出生后第4天（P4）的小鼠心肌细胞做了超级增强子（superenhancer：SE）分析，发现PHF7也被H3k27ac信号定义为SE区域，PHF7与心肌转录因子共同结合在PHF7的SE区域。P4小鼠心脏中发现Gata4、Tbx5以及Nkx2-5在体内也结合在PHF7基因的TSS区域，说明体内也存在这种调控方式。在加入PHF7以及AGHMT五因子的条件下，心肌细胞成熟的标记基因Myh6以及Myh7基因区域有明显的PHF7的结合，并且与P4小鼠心脏中的富集程度类似。除此以外，该区域也有明显的H3K27ac富集以及GHMT转录因子的结合（图5h）。综上，PHF7很可能与Gata4、Hand2、Mef2c以及Tbx5基因，形成心肌细胞转录因子形成自调控循环。
图6：PHF7与SMARCD3互作促进重编程过程
鉴于PHF7在染色质结构中的作用，他们试图寻找与PHF7相互作用的蛋白，鉴定与PHF7结合的相关重构复合体。他们利用生物素标记的邻位连接技术，侵染MEFs细胞。邻近标记(Proximitylabeling,PL)的原理是将一个具有邻近标记功能的酶（miniTurbo连接酶）与目标蛋白融合，再通过酶催化的共价修饰将邻近的蛋白标记上生物素，最后通过亲和素磁珠对生物素标记蛋白进行富集与鉴定。
他们设置了PHF7mTurbo对照组以及AGHMT+PHF7mTurbo的实验组，蛋白质组学分析，除了鉴定到与心肌发育相关的蛋白以外，还发现了SMARCD3（BAF60c），它是SWI/SNF复合体的亚基，对于心脏发育，破坏核小体调控心肌转录因子结合，增殖能力以及Wnt信号通路等很关键（10,30,31）。通过免疫共沉淀，他们鉴定到PHF7与SMARCD3之间有相互作用。为了进一步确定它们之间相互作用对于心肌细胞重编程的上下游调控关系，他们进一步在AGHMT重编程条件下过表达了SMARCD3基因，发现并没有促进重编程的效率；进一步敲低Smarcd3基因，重编程的效率也没有降低（图6f,h,g）。而在加入PHF7的条件下，敲低Smarcd3基因则明显地降低了PHF7对于重编程的促进效果，基本上检测不到PHF7的促进作用（图6h,g）。这说明SMARCD3和可能是通过PHF7在心肌细胞重编程过程中发挥作用的。
总
结
在这项研究中，他们鉴定到组蛋白阅读器PHF7可以结合在成纤维细胞的心肌超级增强子区域，通过与SWI/SNF复合体结合，促进染色质的开放程度，并且促进了相关转录因子的结合。PHF7进一步募集心脏转录因子，形成一个正向转录调控循环（图6i）。很有意思的是，PHF7甚至可以在没有Gata4存在的条件下，有效促进重编程过程的发生。他们的研究工作以PHF7为例，通过PHF7对染色质进行重构以及形成转录复合体，跨越心脏重编程过程中的关键障碍，强调了心脏表观阅读器的重要性，揭示了表观修饰在心肌细胞重编程过程中的关键作用。
分析
在没有重编程因子的条件下，PHF7在成纤维细胞中识别心脏发育相关的增强子，说明其发挥作用是在早期阶段，在加入重编程因子可以促进这种结合，可能PHF7在AGHMT五因子促进的条件下，作为组蛋白阅读器的作用，通过识别这些区域的H3K4me2以及H3K4me3修饰，再通过与SWI/SNF复合体的SMARCD3亚基结合，促进了这些增强子区域的染色质开放程度，进而促进了它们的表达，进一步与这些重编程相关基因形成互相促进的正向循环网络。PHF7可能通过SWI/SNF的作用，剔除这些增强子区域的组蛋白抑制性信号。简化治疗过程中的因子，对于重编程的成功具有指导性意义。这项研究中还发现，PHF7基本可以替代重编程的前导因子Gata4的作用，并且可以促进Mef2c在靶基因上的结合，同时也可以募集Mef2c激活正向调控的转录循环系统。通过这种机制，PHF7可以很好地跨越表观障碍。
目前我们关于表观调控机制在心肌细胞重编程过程中的研究还很有限，敲低多梳蛋白复合体Bmi1，可以在MT因子存在的条件下，促进该过程发生[9]；在Gata4以及Tbx5存在的条件下过表达SMARCD3，可以促进中胚层分化为心肌细胞样的细胞[10]。心脏重编程在临床治疗上很有潜力，但仍然存在许多障碍，最主要的就是人类的纤维细胞向心肌命运转化过程中的表观修饰的障碍。虽然转录因子对于这个过程很关键，但是它们的作用往往也依赖于染色质重塑过程[7,11,12]。这项研究发现了PHF7的重要作用，对于更有效地研究成体纤维细胞向心肌细胞重编程的过程提供了很好的基础，在这个过程中可能参与的其他与表观相关的调控方式，也值得进一步研究。
文章中的研究工作表明，PHF7与这些心源性转录因子之间是相互促进的关系，但是没有很好地说明它们之间的的关系。PHF7可以一定程度上替代Gata4的作用，它们之间除了相互促进关系，可能还存在上下游关系。在重编程过程中，除了将心源性转录因子过表达以外，表观修饰，信号通路，自噬过程[13]等的关键调控基因的调控，也同样很重要，它们的共同作用，可能会更好地促进这个过程的发生。
参考文献：
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