细胞具有在体外自组装成多细胞球的能力。这些细胞球被广泛应用于模拟人体器官，研究人类的发育和疾病，与传统的单层培养相比，它们具有更好的可预测性和生理结构与功能，因此有望成为药物筛选平台。事实上，细胞球中的高细胞密度增强了维持细胞分化和表型所需的细胞-细胞和细胞-细胞外基质（ECM）的相互作用，而这些相互作用在传统2D培养中受到限制。高细胞密度是准确再现许多病理性疾病状态（如癌症或纤维化）所必需的，细胞间和细胞ECM相互作用的紊乱和疾病发展有重大关联。
虽然球状培养物由于其高细胞密度而具有巨大的潜力，但很难在更大的长度尺度上控制其形态，引入多组织异质性，这限制了它们作为体外模型的使用。在体外模型中，细胞和ECM的模式是影响疾病发展的重要因素之一。例如，在心脏、肝脏和肺的纤维化期间，非功能性纤维化组织持续存在于健康的实质内，促进瘢痕的形成和最终的器官衰竭。利用生物制造工具，通过定向放置细胞球使之融合，可以在更大空间范围内控制细胞球的组装，提高模型的生理相关性。
传统生物制造技术主要用于处理嵌在水凝胶中的细胞，水凝胶和细胞的混合限制了细胞间的相互作用，结构细胞密度也相对较低。这推动了专门为细胞球定制的生物制造技术的发展，通常称为生物组装。在早期的方法中，挤压生物打印被用来让细胞球融合成更大的组织链。最近生物组装技术的进步使得单个细胞球的直接加工成为可能。例如，细胞球可以吸入，然后斜插在支持金属针（即kenzan方法）上进行融合，水凝胶也被用于支持基于抽吸的打印方法。尽管这些生物组装技术取得了进展，但仍然存在重大挑战，如何在不需要机械破坏细胞球或使用外部刺激来启动水凝胶交联的情况下促进细胞球融合已经成为了一个棘手的科学问题。这里，该团队报告了一种方法，其中细胞球在剪切变稀的水凝胶内平移，该水凝胶可以自愈合并支撑定位后的细胞球，也支持细胞球间的定向融合。支撑水凝胶的自愈合特性使细胞球能被精确定位（高达细胞球直径的10%）并保持高活性（约95%），而自愈合水凝胶的粘弹性和非粘附性有助于在培养过程中促进相邻细胞球间的可控融合，形成稳定的结构。
为了证明这种生物打印方法的实用性，该团队通过生物打印含有诱导多能干细胞（iPSC）衍生的心肌细胞和原代人心脏成纤维细胞（CF）的细胞球，建立了一种模拟心肌梗死后瘢痕形成的心脏病模型。生物打印模型复制了心肌梗死后出现的心脏病变（收缩输出量减少和电同步）。同时，该团队利用该模型探索了miRNA疗法对心肌细胞增殖的影响。
1、自愈合水凝胶中的细胞球三维打印
为了实现细胞球的三维打印，该团队开发了一种在自愈合特性水凝胶中生物打印细胞球的方法，包括：（i）在介质储层中真空抽吸细胞球，（ii）利用细胞球的剪切变稀特性，将细胞球直接转移到支持水凝胶中，（iii）通过真空去除和水凝胶自愈，在水凝胶中的任何位置沉积细胞球（图1ai–iii）。两个贮存器之间通过狭窄通道连接，保证了打印过程中细胞球的转移。这种方法避免了在气液界面剪切对细胞活性的影响。所使用的载体水凝胶是用金刚烷（Ad）或β-环糊精（CD）修饰的透明质酸（HA），具有剪切变稀和自愈合特性，表现为水凝胶粘度随剪切速率的增加而降低，储能模量在高应变到低应变的循环中恢复（图1b）。
图1自愈支持水凝胶中的三维生物打印细胞球
细胞球以μm/s的恒定速度从介质储液罐转移到支撑凝胶中，每个细胞球的打印时间约为40s（总距离为12mm）。
为了观察细胞球生物打印过程中水凝胶的运动，该团队将FITC微粒嵌入到支撑水凝胶中，并使用粒子图像测速（PIV）分析来跟踪微粒的运动。剪切变稀特性允许支撑水凝胶被局部破坏以适应细胞球平移（图1ci–ii），自愈合特性允许水凝胶在释放真空后重新组装以将细胞球保持在适当位置（图1ciii）。相对粒子运动的定量映射表明，剪切屈服主要产生于平移细胞球的前部约μm范围内（图1civ）。由于水凝胶固有的特性，生物打印过程可以重复进行，允许水凝胶内的多个细胞球沉积在先前未被占据的3D空间中的任何位置（图1a）。
在说明了该方法的可打印性后，可进一步探讨水凝胶流变性能和打印精度的关系。将聚合物浓度从3%增加到7wt%，使水凝胶具有更高的储存模量，需要更高的应变来启动屈服（图2ai–iii）。为评估打印精度，该团队开发了分析方法。对于XY精度，该团队测量了所有聚合物浓度下约8–15%细胞球直径（或约15–60μm）的漂移距离（图2bi）。对于Z精度，该团队测量了所有聚合物浓度下约10–15%细胞球直径（或约25–60μm）的类似漂移距离（图2bii）。这些漂移距离可能是由于细胞球沉积后平移微移液管破坏凝胶造成的。这也可以通过细胞球平移期间（细胞球左侧）水凝胶位移的荧光映射来可视化（图1civ）。通常，这些距离很小，这表明生物打印细胞球的精度很高，并支持将细胞球高分辨率生物打印成图案。
图2支持水凝胶流变性能和3D生物打印精度
接下来，为了突出该打印方法的多功能性，该团队将多个紧密接触的细胞球沉积到一个分层金字塔结构中（图2ci）或作为两个不同的细胞球群体（用FITC和罗丹明预先标记）沉积到分层环中（图2cii）。这些结果表明，载体水凝胶的剪切变稀和自愈合特性允许细胞球在水凝胶内自由移动以形成多细胞球结构。
2、定向细胞球融合三维生物打印高密度组织模型
在确定可以在自愈支持水凝胶内高分辨率三维生物打印细胞球之后，接下来探索定向细胞球融合是否可以用于制造具有受控结构的多细胞球微组织（图3a）。当直接接触生物打印细胞球时，在四天的培养过程中观察到融合（图3bi–ii）。此外，当以50μm的分离距离对细胞球进行生物打印时，观察到可比较的融合水平（图3bii）。这说明在该打印技术精度下，细胞球融合是一定会发生的。利用这些特性，该团队将八个细胞球沉积成一个环形图案，培养4天后可以连续融合成一个微组织环（图3ci–ii）。这个过程可以用多层细胞球重复，形成一个微组织管（图3ciii）。重要的是，由于载体水凝胶中交联的非共价和可逆性质，以及软水凝胶的机械性能（G′~Pa），可以轻轻地将自组装后的结构从支持性水凝胶中移出（图3ciii）。
图3三维生物打印显微组织通过定向细胞球融合
3、三维生物打印心脏微组织在疾病建模中的应用
几乎所有的心脏疾病都涉及由CF增殖和ECM沉积引起的病理性纤维化重塑。CFs本身不能产生动作电位，过量的ECM产生会降低心肌细胞（CM）的连接性，导致组织顺应性和电同步性降低。心肌梗死后出现的局灶性心脏纤维化是一个主要的临床问题，常常导致一系列病理性重塑，并可能导致心力衰竭。
该团队设计了一个局部心脏纤维化的还原模型。为了模拟健康和纤维化的心脏组织，该团队通过将iPSC衍生的心肌细胞（iPSC-CMs）和CFs以不同比例混合（4:1iPSC-CMs与CFs代表“健康”；1:4iPSC-CMs与CFs代表“疤痕”）来制备细胞球（图4ai），通过心肌肌钙蛋白-T（cTnT）（CM标记物）和波形蛋白（CF标记物）的免疫荧光染色进行验证（图4aii）。iPSCCMs是用于心脏细胞球研究的CMs的常见来源。α-肌动蛋白的免疫荧光染色也显示健康细胞球中的强大肌节形成，而瘢痕细胞球中肌节形成有限（图4ai）。接下来，该团队进行收缩记录，并使用开源肌肉运动软件测定收缩幅度（与收缩力相关）和峰间时间（搏动频率或节奏）。与疤痕对照组相比，健康细胞球在第3天时收缩幅度显著增加，峰-峰时间更快（图4b）。细胞内Ca2+的光学标测显示健康细胞球中的Ca2+通量强劲且同步，而瘢痕细胞球中Ca2+通量水平较低且仅分散。接下来，该团队量化了心脏细胞周期的关键参数，包括钙瞬变持续时间（CTD）（ms）、达峰时间（ms）和钙通量振幅（F/Fo）（图4c）。结果显示，健康细胞球的CTD和钙通量振幅显著较高（图4ci，iii），而健康细胞球的峰值时间显著较低（即更快的去极化）（图4cii）。这些都表明通过调整心脏细胞球中CM:CF比率，可以构建健康和瘢痕心脏组织的模型。
图4用于疾病建模应用的心脏细胞球的制造
为了建立局灶性心脏纤维化模型，该团队利用该生物打印技术将健康和疤痕细胞球的定向融合，制造出心脏组织的异质环。该团队用直接接触的8个健康细胞球的融合结构代表健康心肌，而用7个健康细胞球和1个瘢痕细胞球的融合结构代表瘢痕心肌（图5ai）。培养5天后，cTnT和波形蛋白的双重染色证实了相邻细胞球之间的融合。在瘢痕微组织中观察到高成纤维细胞密度区域（图5aii），在微组织的健康区域也观察到强烈的肌节染色（图5aiii）。此外，细胞边界处的连接蛋白-43染色表明在微组织的健康区域中形成缝隙连接，而瘢痕组织中连接明显不足（图5aiv）。微组织环也以连续且同步的方式收缩（图5bi）。微组织收缩的量化显示，与健康对照组相比，瘢痕微组织的收缩幅度有降低的趋势（图5bii–iii），成功模拟了心肌梗死后出现的整体收缩力降低。
接下来，使用光学钙标测来评估纤维化疤痕对微组织电生理特性的影响。健康的微组织显示钙激活在整个环中同步传播，表明融合细胞球之间存在功能性电耦合（图5ci）。相反，在疤痕微组织中观察到类波传播（图5ci）。对荧光记录的连续帧的结果显示，疤痕中的钙通量有限，疤痕两侧健康区域之间的激活延迟（图5ci）。为了观察激活延迟，该团队绘制了直接邻近瘢痕的两个健康区域的钙激活图像，与健康对照组中相同定位细胞球的测量结果相比，显示重叠减少（图5cii）。此外，激活图也证实了疤痕区域的延迟增加（图5ciii），可以量化为平均激活延迟（疤痕前后激活时间的差异），并且显著高于健康对照组（图5ciii）。
图5用于疾病建模应用的3D生物打印心脏微组织
为了进一步证明该团队用于疾病建模应用的生物打印方法的模块性，该团队打印了含有多个疤痕的微组织，以探讨这是否会加剧健康组织中的电失同步。该团队打印了8个健康细胞球和2个疤痕细胞球（疤痕2×），然后在支持水凝胶中融合5天，将其与含有9个健康细胞球和1个疤痕细胞球（疤痕1×）的单个疤痕对照组进行比较。与单个瘢痕对照组相比，含有两个瘢痕的微组织中钙通量的光学标测显示激活延迟显著增加（图5di，ii）。最后，该团队量化了微组织健康区域和疤痕区域（疤痕1×）的局部激活参数，显示CTD和钙通量振幅降低，同时疤痕区域的峰值时间较慢（图5ei–iii）。这一数据证实了微组织疤痕区域内较低水平的电激活，从而导致微组织水平的激活延迟（同步性降低）。总之，这表明打印疤痕破坏了工程化心脏微组织的电生理同步，为探索异种细胞相互作用如何影响心脏疾病状态下的电生理特性提供了一个平台。
4、心肌微组织对miRNA治疗反应的行为学评价
心肌梗死导致细胞死亡后，心肌组织自身修复能力有限。近期临床前证据表明，抑制miRNA的Hippo途径可刺激CM增殖。然而，在最近的猪心肌梗死模型中，病毒转染Hippo过度抑制miRNA-a的表达，导致了过度的心肌细胞去分化和增殖，使得70%的猪心衰。这里的心脏微组织模型则可以用于评估治疗程度对心肌细胞增殖和心脏修复（如收缩性、钙的繁殖）的影响。
首先，该团队使用瘢痕心脏细胞球筛选了一系列miRNA治疗持续时间（0、0-2、0-4和0-7天）（图6ai）。为了评估miRNA治疗的短暂效应，在第2天、第4天和第7天进行了序列收缩成像。与同一时间点未经治疗的对照组相比，持续治疗4天和7天观察到收缩幅度显著增加（图6aii）。值得注意的是，在这些条件下，收缩值增加了大约三倍，接近健康细胞球收缩幅度的20%。当miRNA仍存在于培养基中时（第4天处理0-4天，第7天处理0-7天），与对照组相比，收缩速度也显著增加（快约2倍）（图6aiii）。
图6评估miRNA对心脏微组织行为的影响
为了确定miRNA治疗是否促进瘢痕球中的CM和CF增殖，该团队在7天进行EdU标记（增殖标记），并进行cTnT和vimentin染色的联合染色（图6bi）。cTnT+EdU+存在，表明心肌增殖（图6bi），特别是第4天和第7天（图6bii）。未观察到波形蛋白+Edu+细胞数量的增加，表明miRNA治疗主要影响CM增殖（图6biii）。
在确定miRb/c模拟刺激CM增殖和提高瘢痕球的功能特性之后，接下来评估这些改进是否能转化为组织水平的修复。使用心肌微组织模型，用miRNA治疗4天（图6ci）。通过钙映射（图6cII）评估组织水平的电生理特性。进一步证实了单细胞球的改进，与未治疗对照相比，miRNA治疗显著减少了瘢痕微组织中的激活延迟（图6ciii，iv）。miRNA处理可提高组织CTD和钙通量幅值，显著缩短微组织瘢痕区的峰值时间。最后，瘢痕界面的组织学染色使该团队能够观察到miRNA治疗后组织重构的反应（图6d）。这些都表明，该模型可以用于评价miRNA对心肌组织的修复。
本研究提出了一种新的细胞球打印方法。细胞球可以在剪切变稀的水凝胶内移动，该水凝胶可以自愈合以定位细胞球。通过细胞球间的定向融合可形成具有特定形状的高细胞密度微组织。为证明这种生物打印方法的实用性，该团队通过生物打印含有诱导多能干细胞（iPSC）衍生的心肌细胞和原代人心脏成纤维细胞（CF）的细胞球，建立了一种模拟心肌梗死后瘢痕形成的心脏病模型。生物打印模型复制了心肌梗死后出现的心脏病变（收缩输出量减少和电同步）。同时，该团队利用该模型探索了miRNA疗法对心肌细胞增殖的影响。该打印方法在构建具有空间异质性和高细胞密度模型方面有重要意义。
Daly,AndrewC.,MatthewD.Davidson,andJasonA.Burdick."3dBioprintingofHighCell-DensityHeterogeneousTissueModelsthroughSpheroidFusionwithinSelf-HealingHydrogels."NatureCommunications12,no.1().